西尼羅病毒IGM檢測試劑盒

僅供科研使用

用途

美國FOCUS西尼羅河（West Nile）病毒IMM ELISA，利用了西尼羅重組抗原檢測人體血清或血漿中的西尼羅抗體。本實(shí)驗(yàn)僅用于輔助診斷人感染了西尼羅病毒，不用于篩查血液或血液成分。僅供專業(yè)人員體外診斷使用。

概述

 感染了西尼羅病毒會導(dǎo)致包括腦炎等一系列癥狀的疾病，西尼羅病毒在世界廣泛傳播，已在50多個(gè)國家檢測出該病毒。本試驗(yàn)經(jīng)CDC提供的試劑檢驗(yàn)與驗(yàn)證。本試驗(yàn)使用了一種稱為WNRA的重組抗原，它可以作為西尼羅病毒感染的快速血清學(xué)指標(biāo)，WNRA蛋白是一種重組抗原，它是由含有西尼羅病毒兩個(gè)抗原的序列多肽構(gòu)成。

實(shí)驗(yàn)的原理

檢測西尼羅病毒IMM ELISA 是基于兩步夾心法原理制造的。

提供的材料

1.        微孔板（96孔 12x8）：即用  每孔均包被結(jié)合西尼羅重組抗原的單抗。2－8℃下保存至保質(zhì)期。

注意：WNRA和NCA已包被于微孔板。

2.        IMM樣品稀釋液：1支 25ml 即用 2-8℃下保存至使用。

3.        IMM陰性質(zhì)控：1支 30ul  2-8℃下保存至使用。要長時(shí)間儲存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲存。

4.        IMM陽性質(zhì)控：1支 30ul  2-8℃下保存至使用。要長時(shí)間儲存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲存。

5.        洗滌液（10X）：1瓶 120ml  2－8℃下保存至使用。

6.        EnWash：1瓶 20ml 2－8℃下保存至使用。

7.        酶聯(lián)物：一瓶6ml 即用 2－8℃下保存至使用。

8.        TMB底物液： 1支 9ml 即用  2－8℃下保存至使用。

9.        終止液；1支6ml 即用  2－8℃下保存至使用。

試劑應(yīng)避免反復(fù)凍融。

操作步驟

在使用前將所有試劑和樣品平衡至室溫，并輕輕倒轉(zhuǎn)使其充分混勻。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

將10X的濃縮洗滌液稀釋,將120ml的濃縮洗滌液加上1080ml的蒸餾水，搖勻，至無任何沉淀，稀釋好的洗滌液zui多可在室溫下放置兩個(gè)星期。

準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的板條，剩余的板條應(yīng)盡快放入袋子里重新密封，在2－8℃下儲存至保質(zhì)期。

操作步驟

1.     標(biāo)記將要使用的板條，注意微孔板已經(jīng)按照統(tǒng)一排列，如下所述包被西尼羅抗原和質(zhì)控抗原。

2.     將血清樣品﹑陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控同樣地用樣品稀釋液按1：300稀釋。

3.       每孔加入50ul稀釋后的樣品，以下為一個(gè)血清樣品使用一個(gè)板條的*。

4.       封板，在濕潤的溫育器里37℃下溫育1小時(shí)。

5.       溫育后，用自動洗板機(jī)，使用洗滌液洗板6次。

6.       在每孔中加入50ul的酶聯(lián)物。

7.       封板，在濕潤的溫育器里37℃下溫育1小時(shí)。

8.       溫育后，用自動洗板機(jī)，使用洗滌液洗板6次。

9.       每孔加入150ul的EnWash，在室溫下溫育5分鐘

10.   溫育后，用自動洗板機(jī)，使用洗滌液洗板6次。

11.   每孔加入75ul的TMB底物液。

12.   封板，在室溫下，避光處溫育10分鐘。

13.   每孔加入50ul的終止液終止反應(yīng)。

14.   在450nm處讀取吸光率。

結(jié)果的計(jì)算

結(jié)果的變化將會非常大，以下結(jié)果僅供指引。

計(jì)算ISR值：

計(jì)算在同一實(shí)驗(yàn)里WNR抗原的兩個(gè)陰性質(zhì)控的平均值，計(jì)算同一實(shí)驗(yàn)里NC抗原的兩個(gè)陰性質(zhì)控的平均值，用WNRA/NCA，得出陰性質(zhì)控的ISR值。同樣地計(jì)算陽性質(zhì)控和樣品得ISR值，陽性質(zhì)控的ISR值應(yīng)高于3.0，陰性質(zhì)控的ISR值應(yīng)低于1.5。

結(jié)果的判斷：

在某些特殊的例子中，曾報(bào)道有假陽性，但對梅毒病人無限制。假如樣品的ISR值大于2.0，但是WNRA和NCA的OD值均偏低，可視為潛在假陽性。以下為樣品1排除標(biāo)準(zhǔn)的范例。

排除標(biāo)準(zhǔn)：

計(jì)算陰性質(zhì)控的WNRA和NCA值：

平均WNRA=0.260/2=0.130

     NCA=0.236/2=0.118

     ISR=0.130/0.118=1.10

任何陰性質(zhì)控的ISR值高于1.5，則實(shí)驗(yàn)需要重做。

計(jì)算陽性質(zhì)控的WNRA和NCA值：

平均WNRA=1.290/2=0.645

     NCA=0.368/2=0.184

     ISR=0.645/0.184=3.5

任何陽性質(zhì)控的ISR值低于3.0，則實(shí)驗(yàn)需要重做。

以下標(biāo)準(zhǔn)是必需遵守的，不滿足以下標(biāo)準(zhǔn)，試劑出現(xiàn)了質(zhì)量問題或操作錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)需重做。

解釋結(jié)果

1.       樣品的ISR值大于3.0視為陽性。

2.       陽性結(jié)果需重做證明。

3.       樣品的ISR值小于2.0視為陰性。

4.       樣品的ISR值小于3.0但是大于2.0，視為未確定，但是很有可能陽性，實(shí)驗(yàn)需一式三份重做。

5.       ISR值大于2.0是因?yàn)?/span>WNRA和NCA的值都低造成的，應(yīng)該視為潛在假陽性。

樣品1低OD值的范例：
計(jì)算樣品的WNRA和NCA值：

平均WNRA=0.060/2=0.030

     NCA=0.026/2=0.013

     ISR=0.030/0.013=2.31

雖然樣品的ISR值高于2.0，但是本樣品需視為假陽性，因?yàn)槠?/span>OD值低，而且遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)品，這通常在空白值高的情況下發(fā)生。

要進(jìn)一步證實(shí)樣品，所有陽性的結(jié)果都要用6，2層析稀釋滴定法重做，與相同滴定法的陰性質(zhì)控相比較，假如曲線是？？的，平的或者是波浪型的曲線，則表明為假陽性的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)的局限性

1.           樣品的OD值高于抗原質(zhì)控（非WNRA）,導(dǎo)致ISR值小于3.0，則可能為假陰性，再釋稀樣品重新實(shí)驗(yàn)，可能會獲得真正的ISR值。

2.          既然這不是一個(gè)直接檢測的方法，則需考慮假陽性和假陰性存在的可能性。

3.          所有有反應(yīng)的樣品，應(yīng)用確定性實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

4.          本實(shí)驗(yàn)提供的試劑，盡可能地檢測血清或血漿中的WNRA反應(yīng)性抗體水平。

5.          應(yīng)避免反復(fù)凍融樣品和試劑。

6.          不要使用溶血或脂血的樣品，它們會導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

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該說明書由健侖生物技術(shù)人員編譯，請與英文原文為準(zhǔn)，謝謝!